环状RNA (circRNA)是真核生物中共价封闭的内源性生物分子，其表达模式上具有组织特异性和细胞特异性。其生物发生受特定的顺式作用元件和反式作用因子的调控，许多环状RNA可通过充当microRNA的“海绵”或某些蛋白质的抑制剂，参与调控糖尿病、神经系统疾病、心血管疾病和癌症等疾病的发展，因此，环状RNA一直是科研人员关注的热点研究之一。本期小编就和大家分享一篇套路模式比较简单、质量层次又比较高的一篇高分文献，一起学习其他科研人关于circRNA的研究思路。
影响因子：IF=27.4(Q1)
疾病类型：结肠直肠癌
机制方向：上皮间质转化 (Epithelial-mesenchymal transition, EMT)
研究结论
研究者发现了一个新的环状RNA CircPTK2，其在CRC组织中升高，并与肿瘤生长、转移、高表达与较差的生存预后均呈正相关。本研究表明circPTK2通过结合vimentin蛋白的Ser38、Ser55和Ser82位点促进CRC细胞在体内外的EMT发生，并进一步证明了circPTK2通过下调或过表达vimentin介导CRC的调控。
此外，在患者来源的结直肠癌异种移植模型中（PDTX），尾静脉注射特异性靶向circPTK2的shRNA可以阻断肿瘤转移。
研究解析
01 发现差异表达的circRNA-临床样本
采用circRNA芯片检测6对结肠直肠癌临床样本中（癌旁VS. 癌）的circRNA的表达，筛选出30个差异circRNA(FC>2,p<0.05),并通过文献检测和功能分析，聚焦到目的分子circPTK2。然后于结直肠癌细胞系SW620、LOVO、SW480、HCT15（低氧和常氧条件）以及临床组织样本中检测circPTK2的表达和定位。发现：circRNA在低氧诱导下出现高表达，定位未发生改变（图1 C-E）；癌组织中较癌旁极高表达（图1 G）。
图1
02 差异表达验证和生存期分析-临床样本
qPCR结果显示，在不同分期的TNM样本中，CRC组织中circPTK2的丰度明显高于相邻组织且在淋巴结转移和发生远端转移的样本中呈现更高的表达（图2A-B）;RNA-ISH显示circPTK2 在癌组织中高表达(图 2C)，并且生信分析发现高表达circPTK2的样本总生存率较差(图2E)。
图2
03 circRNA功能验证-细胞水平和动物水平
选取结直肠癌细胞系SW620和SW480并通过对目的基因进行敲减或过表达，分别在细胞和动物水平检测增殖和转移的功能表型。结果表明：circPTK2的下调抑制细胞的增殖、转移和侵袭，促进细胞凋亡；circPTK2的过表达，则促进细胞的增殖、转移和侵袭，抑制细胞凋亡的发生，如图3。
图3
04 机制探究-RNA pulldown/-质谱/-WB
介于上述该基因在细胞、动物水平的功能表型，作者接下来通过RNA pulldown实验探究circPTK2的下游靶基因或靶蛋白。结果发现，玻形蛋白VIM可以和circPTK2结合（图4B-E），并且和circPTK2表达呈正相关（图4A）。同时通过RNAscope 和免疫组化发现两个基因存在共定位（图4E）且鉴定到主要结合位点（图4F），并在细胞和动物水平验证了靶蛋白VIM的功能（图4G-J）。
图4
05 机制探究- PDTX模型
为进一步验证circPTK2调控肿瘤细胞增殖和转移的机制，作者设计了技术难度比较大的人源肿瘤异体移植模型(PDTX)，在该模型上验证更贴近于临床研究，结果更具有说服力，同时也是把整个研究层次拉到一定高度的关键验证型实验。如图5，作者分别将处于phase I 和phase II的24个临床病人（低表达和高表达circPTK2组）的肿瘤组织移植到小鼠皮下，经3代制备成模型；通过尾静脉注射circPTK2 特异性shRNA 病毒（敲减或者过表达）到模型鼠中，然后检测 VIM的表达变化（图5 D）和细胞的增殖和转移的变化（图5E-G）。从结果可以看出在结直肠癌患者源性的异种肿瘤模型中，通过尾静脉注射靶向circPTK2的shRNA可显著抑制肿瘤转移。
图5
这篇文章的研究思路是比较常见的circRNA研究思路之一，作者从临床样本出发，通过基因芯片检测确定了癌和癌旁中差异表达的目的基因circPTK2，然后回到不同分级的临床样本中做表达验证和相关的生存预后分析，并在在细胞、动物水平验证该circRNA的功能表型；接着作者通过RNA pulldown鉴定到了关键下游明星蛋白Vimentin（细胞发生上皮间质转化 (EMT)时，该蛋白表达上调），并在细胞和动物水平进行了验证。实验至此，已经是比较完整的研究了，但是作者又设计了PDTX模型，利用此模型再一次验证了上述研究结果，丰富了整个文章机制部分的证据链，比较全面的验证了这一经典的研究思路：基因A（circPTK2）通过B机制（EMT）影响C疾病（结肠直肠癌）的D功能（增殖和转移）。
病毒实验帮
公众号底部菜单栏【新功能】上线！
免费在线学习《国自然热点研究》、《数据库及软件操作教程》
一键下载《病毒使用手册》、《高分文献》
还有不定时的送新书、抽奖活动，赶紧来关注一波吧