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新发现!利用CRISPR/Cas9构建小鼠肺腺癌模型,探索肺腺癌的分子机制

作者:上海吉凯基因医学科技股份有限公司 2021-10-11T16:02 (访问量:8467)

作者:北极星


肺癌是全世界癌症相关疾病死亡的主要原因,每年造成170多万人死亡,5年存活率中位数为19 %。大多数肺癌患者患有肺腺癌,其5年生存率约为10%。肺腺癌较容易发生于女性及不抽烟者,发病年龄较小,女性相对多见。

多数肺腺癌起源于较小的支气管,为周围型肺癌。早期一般没有明显的临床症状,往往在胸部 X 线检查时被发现。由于肺癌早期发现困难,局部复发和远处转移风险高,预后差。因此,搞清楚肺腺癌的分子机理及开发有效的肺癌治疗方法是当务之急。

在人类肺癌中,STK11、PTEN、TP53和KRAS是最常见的突变基因,通过cBioPortal对肺癌基因进行数据分析。

分析结果显示在1144例肺癌样本(其中660例为腺癌,484例为鳞状细胞癌)中,tp53在肺癌的不同亚型中均发生突变,这表明该通路的改变对肺癌的形成至关重要。

STK11和PTEN的突变分析显示,STK11的缺失主要见于腺癌,而PTEN的缺失主要见于SCC(图1)。对KRAS的分析显示,在腺癌中伴随着STK11的缺失。相比之下,SCC中的KRAS突变没有与STK11或PTEN突变同时发生(图1,表1)。这些分析表明,mTOR通路的两个关键调控因子STK11和PTEN在肺癌生物学中具有不同的功能。

图1. stk11、PTEN、KRAS和trp53在人类肺癌中的突变谱



在人类肺癌中,STK11、PTEN、TP53和KRAS是最常见的突变基因,基因工程小鼠模型(GEMM)是分析肺癌中癌症相关基因功能的关键。

本研究以这几个基因为研究对象,利用CRISPR/Cas9构建小鼠肺腺癌模型(图2a),比较Stk11和Pten在结合Trp53缺失和Kras功能获得的肺癌中的作用。小鼠接种含有SKT的AAV病毒(图2c), 10周后检查肺。石蜡切片证实转基因小鼠的肺异常和Cas9/GFP表达激活。


Stk11的缺失加速了肺肿瘤的进展(如图3)。用含有sgRNA的AAV病毒接种小鼠后,通过PET/MRI扫描成像对肿瘤体积进行量化(图3A,B),SKT诱导的肿瘤体积迅速增大。相反,Pten (PKT)诱导的肿瘤体积增长速度较慢,且没有达到与SKT肿瘤相似的体积(图3B)。在Stk11缺陷肿瘤中,肿瘤体积的增加也导致了生存率的降低。

SKT诱导肿瘤的中位总生存期为4个月,PKT肿瘤小鼠的中位总生存期为6个月,而注射AAV-YFP对照病毒的小鼠在6个月期间没有发生肺肿瘤(图3C)。显微镜检查发现Stk11 (SKT)突变诱导的肿瘤数目少但体积很大,PKT突变诱导了多个肿瘤,但这些肿瘤通常较小(图3D)。这些分析表明Skt11是控制肺腺癌的重要抑癌因子,Pten的影响是次要的

图3. Stk11的缺失加速了肺肿瘤的进展


通过对肿瘤样本进行了分析,揭示Stk11缺失对肿瘤增殖的影响。在Stk11肿瘤中,抗Stk11抗体染色呈阴性,Erk通路在KRASG12D阳性肿瘤中被激活;Akt通路在Pten突变肿瘤中被激活,大约一半PKT诱导的肿瘤没有p-Akt染色阳性 (图4b)。肿瘤体积的增加通常与增殖改变有关,用细胞增殖标记物Ki67进行样本染色。

与含有Pten、Trp53和Kras引导物的病毒启动的肿瘤相比,Stk11阴性的肿瘤Ki67阳性细胞大约增加了两倍。而PKT样本中的Ki67阳性细胞与仅由Trp53和Kras突变启动的肿瘤相似。这表明Pten的缺失并不影响该亚型肺肿瘤的增殖能力(图4c)。Western blot分析证实肿瘤样本中Erk激活,部分PKT样本中p-Akt升高(图4d)。这些数据表明,Stk11的缺失与Trp53和Kras的改变共同促进了增殖,而Pten的缺失不影响肿瘤增殖。

图4.Stk11的缺失会增加增殖从而推动肿瘤进展


在本研究证明了Stk11的缺失通过增加增殖和Trp53的缺失及Kras的激活而促进肺腺癌的发生。通过应用CRISPR/Cas9技术生成体内癌症模型,这使人们能够评估个体基因在癌症形成中的功能。肺腺癌STK11突变结合KRAS功能增加和TP53缺失在人类样本中很常见,这证实了CRISPR/Cas9癌症模型反映了人类癌症的机理。

CRISPR/Cas9技术给生命科学领域带来了巨大冲击,CRISPR/Cas9相关研究成果频频登上Cell、Nature、Science等期刊,被誉为“基因编辑 高分文章必备”,也更是拿到了2020的诺贝尔化学奖。

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