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干货来啦!AAV感染小鼠肠道及注射剂量指南

作者:上海吉凯基因医学科技股份有限公司 2021-11-15T14:38 (访问量:7868)

近期,小编接触到很多老师咨询肠道方向的AAV的注射方式,本期我们将对肠道的病毒感染方式及AAV参考剂量进行总结。


首先,我们了解一下肠道系统的结构,小肠全长约4-6米,分为十二指肠、空肠和回肠三部分;上连胃幽门,下接盲肠随后连接大肠(包括盲肠含阑尾、升结肠、结肠右曲、横结肠、结肠左区、降结肠、乙状结肠、直肠)。


常见感染肠道的注射方式主要分为4种,分别为尾静脉注射、腹腔注射、灌肠和肠系膜动脉注射[1,2]。其中系统性的递送途径包括尾静脉注射和腹腔注射,这两种注射方式操作简单,但不具有特异性,除了肠道其他组织器官也有可能感染,同时病毒的损耗也会比较大:


一、 尾静脉注射

尾静脉注射是常见的的系统性注射方式,通过这种方式可以感染全身的大多数器官,它的优点是操作简便,对动物的损伤较小,缺点是无法实现特异性感染,尤其是肝脏、血管等更易感。


具体步骤如下(来源于吉凯平台):

尾静脉注射示意图(图片来源于吉凯)


1. 实验前准备

准备内容:小鼠、小鼠固定器 ( 或 50ml 离心管)、1ml 注射器、酒精棉球、病毒 ( 冰浴融化)、生理盐水或 PBS。


2. 小鼠固定

a. 首先提取小鼠尾巴,将其放在鼠笼盖或手臂上,并进行适当安抚;

b. 然后将小鼠装入固定器 ( 可用 50ml 离心管改造)中,盖紧盖子,并使其尾巴朝外露出;

c. 用酒精棉球擦拭小鼠尾巴,使其血管扩张 ( 也可用热水、加热器等)。


3. 病毒注射

a. 用生理盐水或 PBS 将病毒稀释至合适滴度 ( 控制病毒注射体积在100-200μl);

b. 用 1ml 注射器吸取 100~200μl 病毒;

c. 将小鼠尾巴拉直使其红色静脉清晰可见,在距尾尖 1/3 处进针,缓慢注入病毒后拔出,用棉球按压注射点 1min 左右以止血。


4. 动物恢复

将小鼠从固定器上取下,放回原饲养笼中。


二、腹腔注射

腹腔注射的方式适用于脂肪、肌肉、胰腺、肠道等全身器官,以及新生鼠(造成的损伤较小),通过这种递送途径,肠道的平滑肌及浆膜感染概率更大,可以观测到散在的GFP染色,但是上皮细胞感染的概率较小。


具体步骤如下(来源于吉凯平台):

腹腔注射示意图(图片来源于吉凯)


1. 实验前准备

准备内容:小鼠、病毒液 ( 冰浴融化)、1ml 注射器。

吸取病毒:用 1ml 注射器吸取适量病毒,置于冰上备用。


2. 小鼠固定

a. 首先提取小鼠尾巴,将其放在鼠笼盖或手臂上,并进行适当安抚;

b. 然后左手握小鼠,用拇指和食指捏住小鼠颈背部,用无名指及小指固定其尾和后肢,确保小鼠躯体舒展且不能乱动。


3. 病毒注射

a. 右手取吸好病毒的注射器,翻转左手使小鼠头部朝下且腹部完全暴露给操作者;

b. 手持注射器在下腹部离腹白线约 0.5cm 处下针,使针头与小鼠腹部约成 30°夹角刺入腹部,刺入过程中如感觉到抵抗力突然消失,表明针头已进入腹腔,此时调整针头方向约与小鼠腹部平行,缓缓进针;

c. 针头进入适当距离后,匀速注射病毒液后,缓缓拔出针头 ( 旋转针头以避免漏液)。


4. 动物复苏

将小鼠放回原饲养笼中,注意观察小鼠状态。


除了系统性的递送方式外也可通过局部注射的方式实现AAV的递送,肠道方向包括灌肠和肠系膜动脉注射的方式,优点是病毒剂量更小、可以直接感染需求部位,但同时也具备一定的缺点,那就是对动物造成的损伤更大。


三、灌肠

有文献报道通过灌肠的方式感染肠道组织,由于需要通过小鼠肛门插管进行灌肠,因此感染深度具有一定的局限性,感染结肠的概率更大,一般小鼠剂量推荐4E10vg/只以上,体积200μl。


具体步骤如下(来源于参考文献[1,3,4]):


1. 实验前准备

准备内容:小鼠、病毒液 ( 冰浴融化)、聚乙xi导管。

吸取病毒:用 1ml 注射器吸取适量病毒,置于冰上备用。


2. 病毒注射

a.首先使用异氟醚麻醉小鼠;

b.然后将聚乙xi软管插入距离离肛门4厘米深的小鼠结肠部位,使用注射器缓慢注入适量的病毒;

c.注射完毕后,将小鼠在垂直倒立状态保持1分钟以上,以确保病毒在结肠部位的均匀分布;

d. 待小鼠复苏后可以恢复正常饮水及饮食。


四、肠系膜动脉注射

肠系膜动脉是分布于消化管的动脉,主要分为肠系膜上动脉和肠系膜下动脉,结合小肠结构图来看,肠系膜上动脉分布于小肠左侧,肠系膜下动脉分布于结肠、大肠及泄殖腔部位,因此通过该方法可以感染小肠及结肠部位的细胞。


具体方法如下(来源于参考文献[1,2,5]):

a. 保定完成后使用异氟醚麻醉小鼠;

b. 通过左上方的皮肤进行1-2 cm的穿刺沿着腋线和侧腹的脾脏区域。切开腹外斜肌暴露SMA(肠系膜动脉)。使用微型牵开器将皮肤和腹壁固定,并用温暖的盐水纱布覆盖小肠防止回缩;

c. 使用微血管放大器在放大20倍的情况下,将SMA轻轻地从腹膜后剥离,在近端伤口周围放置连接注射针,使用一个微型血管钳暂时夹闭血管腹主动脉;

d. 将定制33号1/2‘’英寸点式2型进样针(Hamilton; Reno, NV))连接250 μl汉密尔顿TLL气密性进样针注射器插入肠系膜动脉,轻轻结扎血管保持稳定防止注射泄漏,随后进行病毒注射;

e. 注射结束后取下注射器械,解除夹闭,使血液流回肠道组织。


肠系膜动脉注射示意图


最后,小编对肠道系统的AAV注射方法及剂量进行总结,大家可以根据自己需求进行选择预实验的参考剂量,设置梯度,选择最佳剂量:


肠道系统AAV感染范围及剂量参考


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