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开学季三问 | 第一问:如何选择合适的工具病毒进行实验?

作者:上海吉凯基因医学科技股份有限公司 2021-11-15T14:48 (访问量:3860)

金秋九月,又到了莘莘学子入学的时节,各种实验课题得紧锣密鼓安排上。作为一名经验丰富的技术支持,每年都会遇到大量常见的问题,本月我们先盘点三期同学们困惑的问题:工具类载体那么多,我怎么选合适的做实验呢?


常见的工具载体

市面上常见的,用于递送外源基因实现上调或者下调的工具包含:质粒、慢病毒(LV)、腺病毒(AD)、腺相关病毒(AAV),选对了合适的工具,是获得优质实验结果的重要保障,我们先来看下三种工具病毒的异同点:


我们先看看几种病毒的特点:


慢病毒:因潜伏期、致病期长而得名“慢”,基于HIV病毒来源的慢病毒,其包膜修改为水泡性口炎病毒的VSVG,以拥有针对众多细胞感染能力的特性。其最大特点是感染细胞谱系广,能够整合,做出稳转株,长期稳定表达;


腺病毒:因从腺体中分离而得名,为流感病毒特性,拥有针对大部分细胞高感染的特性,但病毒于细胞存在时间较短(细胞为一周,动物2~3周),适合短时间的高量表达。


腺相关病毒:其复制需要腺病毒的帮助而得名,特点是病毒颗粒极小,适合在动物致密的组织扩散,而且单位体积滴度很高,因此被广泛用于动物实验。但其表达基因的时间较长,且表达水平较低,动物实验需要的周期也较长。


质粒:环状质粒的特性类似腺病毒,都是DNA为遗传物质,表达水平高,且快,但质粒的转染细胞效率与腺病毒是天差地别的,仅对少部分肿瘤细胞或者工具细胞(293、Hela)有较好的递送效果,一般用于做验证类的实验,如双荧光素酶、CoIP等。


如何有效选择工具载体

谈了几种工具的异同点,下面我们谈谈如何有效选择工具载体:

# 细胞实验#


考虑点:感染情况、基因大小、实验周期。三者综合考虑,如:


1.细胞实验周期很长,那么只能考虑用慢病毒做为递质,以稳转株(稳定表达外源基因的细胞株)进行后续实验。


2.若基因太大,超出病毒的包装极限,那只能选择质粒。但质粒递送效率低怎么办?那就使用电转、纳米材料等非常规手段递送。


3.若质粒、慢病毒均无法有效递送,可以试试腺病毒的感染效率(在不考虑慢病毒整合引发的细胞变化,一般细胞实验优先推荐慢病毒,既能感染众多细胞,又能满足长期实验,腺病毒在需要短时间高效表达的情况下,或者其他方式无法递送的情况下才会选择)。


4.质粒、腺病毒属于游离的DNA特性,表达水平高且快;慢病毒由于基因组整合进入染色体,表达水平是要低于前者一个层级的,这点也要考虑在内,对于高表达需求的,尽量使用腺病毒。


常见问题

我要用慢病毒做实验,需要做哪些前期工作呢?

答:对于未接触过的细胞,或者新手,建议做预实验,或者通过公司、文献查阅病毒感染细胞的MOI值(指病毒感染细胞的比例,通俗讲就是有效感染单个细胞需要多少病毒)。确认对应类型的病毒能够感染上,再进行目的病毒的订购,避免时间、成本的浪费。

查询到MOI,是不是就不用做预实验了?

答:保险起见,还是建议做一下,有三个原因:第一,即便是同种细胞,但如果来源不一样,可能谱系上会有差异,导致实际最佳MOI有差异;第二,不同公司的病毒滴度标准有差异,有些以物理滴度标定,有些以活性滴度标定等;第三,很多细胞实验最终是要筛选稳转株的,因此需要摸索最佳抗性的浓度,这个浓度一般是查不到的。所以,为了避免耽误时间,在等目的病毒的时候,老老实实做预实验吧!


# 动物实验#


考虑点:注射部位、基因大小、实验周期、成本。

四者者综合考虑,如:


1.三种病毒,从滴度上排序:AAV>AD>LV,滴度越高,等于单位体积内含有的病毒量越多,最终能感染的细胞数就越多,这就是AAV大量用于动物实验的原因。一般注射分为两种方式:


A.系统性注射,如尾静脉、腹腔等,适合针对大型脏器或组织的递送(心、肝、血管、肌肉),三种病毒均可,但慢病毒的成本相对较高,在均可选择的情况下,尽量还是AAV。


B.原位注射,如脑立体、肝门静脉等,这种方式大多需要对动物进行手术,缺点是实验操作要求高,动物容易死亡,但非常节省病毒(约为系统性注射的五分之一),因此,几种病毒都是可以的。


2.常规推荐的AAV,由于总包装极限是4.7k(算上启动子、终止子、标记基因),能分配给基因的容量也就0~3k(要看具体启动子的大小)。若要特异性表达,而恰好对应的特异性启动子较大,超出包装极限,那么AAV就做不了,只能更换LV或者AD。当然,如果也超出后来者的极限,那就得尝试其他技术手段了。


3.慢病毒属于整合型病毒,只要感染,不管细胞分裂与否,都能长期表达;AD不整合,在细胞存在一段时间(2~3周)则会丢失,如果用腺病毒,则需要在病毒注射之后的2周左右,再补注射病毒;AAV虽然也不整合,但其会伴随染色体长期存在,适合在非分裂的细胞长期表达(>6个月),因此,实验周期的确认对应选择何种病毒。


4.表达时间上,AD(1~2天)>LV(3天)>AAV(3~4周),因此,想要快速表达的,就选择前两个。如造模之后只能维持一周,需要外源基因快速表达,那就只能舍弃AAV了。


以上就是小编盘点的常见工具病毒的特性以及使用注意事项。除上述提及的工具载体,吉凯基因还可提供更多优质基因操作工具,如悬浮细胞专用慢病毒、HSV病毒等,此外,还有大量的现货病毒、对照病毒、AAV试用装等,质优价廉,还在等什么,快来咨询吧!!!


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