随着单细胞组学的快速发展，单细胞蛋白质组学（Single-Cell Proteomics, SCP）逐步从方法验证迈向规模化应用阶段，成为揭示细胞功能状态、群体异质性和微环境相互作用的核心技术之一。SCP直接从功能层面探测细胞状态，其研究价值在肿瘤、免疫、干细胞和神经科学等领域日益凸显。但SCP实验的技术门槛极高，尤其在样本制备这一环节，每一步操作都直接影响蛋白的回收率、酶解效率和最终质谱数据的质量。

一、单细胞蛋白分析样本制备标准流程

单细胞蛋白分析的制备流程包括五个主要阶段：单细胞分选、细胞裂解、蛋白酶解、肽段纯化/标记、上样与质谱检测。每一阶段需高度规范、避免误差累积。

1、单细胞分选（Single-Cell Isolation）

目的是从混合样本中分离出目标单细胞，确保每个反应体系中只有一个完整的活细胞。常用技术包括：

• FACS（荧光激活细胞分选）：利用表面标志物实现高纯度分选，适合多通道标记筛选。
• 微流控芯片：适合自动化、高通量实验，操作环境封闭，污染风险低。
• 稀释法或显微操控：操作灵活，适合特殊细胞，但通量有限。

2、细胞裂解与蛋白提取（Lysis & Extraction）

使用质谱兼容的缓冲液（如不含SDS的缓冲液），在低体积反应环境中裂解细胞，释放蛋白质。裂解方式可选择：

• 热裂解：高温破膜，简洁有效。
• 化学裂解：使用温和去污剂辅助裂解。
• 微量机械裂解：配合超声或冷冻-解冻。

3、蛋白还原、烷基化与酶解（Reduction, Alkylation & Digestion）

• 还原剂（如TCEP/DTT）断开二硫键；
• 烷基化剂（如IAA/CAA）封闭巯基，防止重组；
• 加入胰蛋白酶（Trypsin）或Lys-C，在37°C条件下完成长时间酶解（通常6–16小时）。

推荐使用如nanoPOTS、SP3法等自动化微反应体系。

4、肽段纯化与标记（Peptide Cleanup & Labeling）

• 采用C18磁珠、StageTip或微柱进行脱盐，去除酶解缓冲液中的杂质。
• 根据实验设计可进行TMT/iTRAQ等标签标记，实现多样本并行检测与定量。

5、上样与质谱分析（LC-MS/MS Injection）

• 使用纳升液相色谱（nanoLC）系统与高灵敏度质谱仪（如Orbitrap、timsTOF SCP）；
• 采集模式可选DDA、DIA、BoxCar-MS等，提升低丰度肽段识别能力；
• 低体积、高分辨率分析，实现单细胞分辨率的蛋白质定量。

二、样本制备过程中的关键注意事项

即使遵循标准流程，若忽视以下细节，也极易导致蛋白损失、数据偏差甚至实验失败：

1、污染控制与背景干扰

• 全程使用无酶、无蛋白耗材，如低吸附管（LoBind管）、无蛋白移液枪头；
• 操作环境应为洁净区或层流台，减少空气中蛋白、酶等污染源；
• 设置“空白孔”作为背景对照，识别环境噪声信号。

2、蛋白丢失与吸附问题

样本体积越小，越容易因吸附而造成蛋白/肽段损失。建议使用亲水处理的微孔板、硅化处理管壁，降低吸附；可使用磁珠（SP3）策略提高蛋白和肽段的回收率。

3、酶解效率与反应条件

• 控制pH在7.5–8.5，确保胰蛋白酶在最适条件下工作；
• 精准控制温度与反应时间，酶解不足或过度均会影响数据；
• 推荐设置反应内标准，监控酶解一致性。

4、批次效应与通量控制

• 多个单细胞样本之间应同时处理，避免批次差异；
• 引入TMT-bridge或“载体通道”策略做跨批次标准化；
• 样本编号与位置应记录清晰，避免信息混淆。

5、低丰度蛋白识别与数据缺失

• 使用DIA/BoxCar采集策略增加低丰度蛋白识别率；
• 数据分析中应用缺失值填补、强度归一化等算法（如MaxLFQ、DART-ID）；
• 选择合适质谱参数与搜索库，避免过度过滤导致信息丢失。

单细胞蛋白分析是构建“功能组学图谱”的关键手段，而样本制备正是其数据质量的第一道门槛。通过标准化流程与严格细节控制，可以有效提高蛋白识别覆盖率、增强实验可重复性，并为后续多组学整合分析打下坚实基础。作为专注于高通量组学技术的科研服务提供者，百泰派克生物科技始终紧跟单细胞蛋白质组学技术前沿，致力于为科研人员提供可靠、专业的单细胞蛋白质组学分析服务。我们期待与您携手挖掘微观世界的蛋白奥秘，共同拓展生命科学研究的边界。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

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