在重组蛋白表达领域，标签（tag）的选择至关重要，尤其是那些能有效提升目标蛋白溶解度和表达量的“小标签”。其中，NEXT tag 作为一种源自天然 α‑型碳酸酐酶（CA）N 端延伸序列的小肽标签，因其独特优势逐渐受到关注。
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起源与发明人
NEXT tag 源自海洋菌 Hydrogenovibrio marinus 的 α‑型碳酸酐酶（hmCA）N‑端延伸区，由 53 个氨基酸组成（约 5.5 kDa）。Byung Hoon Jo 等人在研究中首次将其提炼为一种能显著提升重组蛋白可溶性与表达量的融合标签。
02
NEXT tag 的氨基酸序列
NEXT tag 的氨基酸序列如下：
AVCHSNAPLIDLGAEMKKQHKEAAPEGAAPAQGKAPAAEAKKEEAPKPKPVV
该序列由 53 个氨基酸组成，分子质量约为 5.5 kDa。研究表明，NEXT tag 是一种“内在无序肽”（IDP），能够通过熵效应排斥周围大分子，从而抑制目标蛋白聚集，特别适合解决低表达、易聚集蛋白的问题。
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应用领域
NEXT tag 是一段“内在无序肽”（intrinsically disordered peptide，IDP），能够通过熵效应排斥周围大分子，从而抑制目标蛋白聚集，特别适合解决低表达、易聚集蛋白的问题。相比传统大标签（如 MBP ~40 kDa、GST ~26 kDa），NEXT tag 更小，对目标蛋白结构和功能影响极小。
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实验设计
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1.体内溶解度实验（In vivo solubility） 将 NEXT tag 与多种难溶性蛋白（hEGF、GFP、taCA、isPETase）融合表达。通过 SDS-PAGE 和 Western blot 分析可溶性与不可溶部分的比例。结果显示 NEXT tag 显著提高了这些蛋白的可溶性表达比例。 2.与其他标签对比实验 将 NEXT tag 与常用标签（MBP、GST、Fh8）进行比较。在高温（37°C）和低温（25°C）条件下表达 GFP 等蛋白，评估可溶性和表达量。NEXT tag 在多数情况下表现最佳，尤其是在高温下仍能维持高溶解度。 3.体外溶解度实验（In vitro solubility） 纯化带有不同标签的 taCA 和 isPETase，改变缓冲液条件（盐浓度、pH）。通过离心和 SDS-PAGE 分析沉淀情况。NEXT tag 能有效防止蛋白在低盐或无盐条件下沉淀。 4.蛋白功能与稳定性测试 测试带有不同标签的 taCA 的酶活性和热稳定性。NEXT tag 对酶活性和稳定性影响最小，优于大标签如 MBP。 5.N端截断实验 将 NEXT tag 逐步截断，分析各区域对溶解度的贡献。发现 C端区域（NEXT₍C₁₆₎）主要负责体外溶解度，N端区域对体内溶解度更重要。 6.结构特性分析 使用生物信息学工具（IUPred2A、PONDR、DISpro）预测 NEXT tag 为内在无序蛋白（IDP）。通过圆二色谱（CD）证实 NEXT tag 无规则卷曲结构，支持其“熵刷”（entropic bristle）机制。 |
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主要结论
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NEXT tag 是一种 53个氨基酸 的短肽标签，具有内在无序特性。
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它能显著提高难表达蛋白的体内和体外溶解度，且对目标蛋白的活性和稳定性影响极小。
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其作用机制类似于“熵刷”，通过空间排斥效应防止蛋白聚集。
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NEXT tag 在小尺寸、无翻译后修饰位点、不影响蛋白功能方面优于传统大标签（如 MBP、GST）。
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应用案例
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在大肠杆菌表达系统中，用于 taCA（Thermovibrio ammonificans CA）的融合表达时，NEXT tag 显著提高了产量与溶解性，比 NT11 标签表现更优。
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与 NT11 标签相比，NEXT‑taCA 在 CO₂ 变水化酶活性方面提升了约 8.4 倍，而 NT11 仅提升约 3.3 倍。
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在长时间热稳定性测试（70 °C, ≥ 35 天）中，NEXT‑tag 使 taCA 的半衰期从 8 天提升至约 10.4 天，稳定性提升约 30 %。
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研究还拓展发现与 NEXT tag 类似的其他 α‑CA N‑端序列（如 Hcr、Hku），也具有显著提升表达与溶解性的能力。
关键参考文献
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Jo BH. An intrinsically disordered peptide tag that confers an unusual solubility to aggregation-prone proteins. Appl Environ Microbiol. 2022;88(7):e00097-22.
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Hwang IS, Kim JH, Jo BH. Enhanced production of a thermostable carbonic anhydrase in Escherichia coli by using a modified NEXT tag. Molecules. 2021;26(19):5830.
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Jo BH, et al. Enhanced production of a thermostable carbonic anhydrase in Escherichia coli by using a modified NEXT tag. Molecules. 2021;26(19):5830.